肽圖分析法 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

有許多蛋白水解酶都能斷開蛋白質(zhì)的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸殘基。包括：

胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個(gè)階段：（注：參考文獻(xiàn)21詳細(xì)回顧了胰蛋白酶的水解）

1. 變性。要在合理的時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)水解，必須對(duì)蛋白質(zhì)作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質(zhì)置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質(zhì)即可變性。

2. 二硫鍵的還原。二硫鍵會(huì)阻止蛋白質(zhì)的完全變性。
   通常可通過在待水解蛋白的變性過程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。

3. 游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態(tài)，則有可能以錯(cuò)誤的方式重新形成二硫鍵。
   為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應(yīng)由100 mM DTT 退火。

4. 脫鹽。當(dāng)溶液中存在尿素或胍鹽時(shí)，水解反應(yīng)無法進(jìn)行，因?yàn)橐鹊鞍酌缸陨碜鳛橐环N蛋白質(zhì)會(huì)變性，失去酶活性。
   尿素或胍鹽必須通過離子交換或滲析去除或?qū)舛冉档椭?/span>1M以下。

5. 胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質(zhì)溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的最高活性pH）的緩沖液中——Tris或碳酸銨，并在20~100個(gè)待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區(qū)間內(nèi)處理蛋白質(zhì)。
   低溫處理時(shí)間長達(dá)16個(gè)小時(shí)。在37℃下，水解可在1~4小時(shí)內(nèi)完成，具體取決于蛋白質(zhì)。
   如果胰蛋白酶的時(shí)間、溫度或相對(duì)濃度均過低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發(fā)生，最終導(dǎo)致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。
   如果胰蛋白酶的水解時(shí)間、溫度或濃度均過高，則會(huì)發(fā)生胰蛋白酶自身溶解，產(chǎn)生“自溶產(chǎn)物”，即胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段，從而造成混淆。
   慣常的做法是忽略蛋白質(zhì)，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質(zhì)完全水解的條件對(duì)得到的樣品進(jìn)行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產(chǎn)物的位置。
   開發(fā)胰蛋白酶水解協(xié)議過程中，對(duì)胰蛋白酶和蛋白質(zhì)的水解時(shí)間、溫度和相對(duì)濃度進(jìn)行了優(yōu)化。
   當(dāng)利用肽圖確定二硫鍵的位置時(shí)，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質(zhì)的水解速度非常慢。
   在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過程中蛋白質(zhì)的變性。
   水解過程中有時(shí)采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質(zhì)，但表面活性劑會(huì)降低色譜分辨率，應(yīng)盡量避免。

胰蛋白酶水解分析。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽段利用反相高效液相色譜分析，流動(dòng)相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導(dǎo)致較早洗脫出肽的色譜的不可重現(xiàn)性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。
梯度洗脫的時(shí)間取決于待水解蛋白的大小。
大分子蛋白比小分子蛋白水解產(chǎn)生更多的肽段，因此肽段的分離需要更長洗脫時(shí)間。
小分子蛋白（小于20kd）水解產(chǎn)生的肽通常可在45~60分鐘內(nèi)完成分離。
大分子蛋白（20-50kd）需要較長的洗脫時(shí)間，一般為60~120分鐘。
分子量大于50kd的蛋白質(zhì)需要120~180分鐘的洗脫時(shí)間。
采用1~2 ml/min 的流速和適宜的溫度時(shí)分辨率最佳。
通常采用C18 反相柱。可以使用孔徑為100埃或300埃的柱子，其選擇性通常不同。

圖31. 牛血清白蛋白的肽圖

色譜柱：ACE 5 C18-300 寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動(dòng)相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 體系，混合梯度洗脫120分鐘。