色譜分析（HPLC）故障排除1 - 峰形問題

峰形問題                                   

可能致因	預(yù)防措施/解決方案
峰拖尾
與活性硅醇的相互作用	使用超高純度硅基（硅膠基質(zhì)）固定相 添加堿性流動相添加劑（如TEA）- 超高純度相則不需要
在固定相中與金屬離子螯合	同上
錯誤的流動相pH值（流動相pH值不當(dāng)）	降低流動相pH值以抑制硅烷醇電離 增加緩沖液濃度
玻璃料阻塞（篩板堵塞）	倒沖洗柱（反沖色譜柱） 使用串聯(lián)（在線）過濾器
柱無效（色譜柱失效）	倒沖洗柱（反沖色譜柱） 更換柱 （色譜柱）
死體積未清掃（過大）	盡量減少連接器數(shù)量 使用較短的連接管 檢查所有配件是否緊固
分裂峰
保護(hù)柱或分析柱入口（進(jìn)樣）端污染	拆下保護(hù)柱卡套（卸除保護(hù)柱芯）并進(jìn)行分析 - 必要時更換保護(hù)柱 倒沖洗（反沖）分析柱 對于頑固殘留（強(qiáng)保留污染物），應(yīng)嘗試再生法（對色譜柱進(jìn)行再生） 更換柱
玻璃料阻塞 （篩板堵塞）	倒沖洗柱（反沖色譜柱） 使用串聯(lián)（在線）過濾器
樣品溶劑與流動相不兼容	在流動相中注入樣品 （用流動相溶解樣品）
同時洗脫第二組分	注射前使用樣品清理 （進(jìn)樣前先凈化樣品） 通過改變流動相或柱相（色譜柱固定相） 來改變選擇性
柱超載（色譜柱過載）	使用更高容量的固定相 增加柱的直徑 （增加色譜柱內(nèi)徑） 減少樣本（樣品）量
伸舌峰
柱中通道的形成 （色譜柱內(nèi)形成通道）	更換柱 （色譜柱） 在建議的色譜柱（色譜柱建議的）pH值范圍內(nèi)操作
柱超載 （色譜柱過載）	注入更少量或更稀釋的樣品溶液 （減少進(jìn)樣體積或進(jìn)一步稀釋樣品） 使用更高容量的固定相
樣品溶劑與流動相不兼容	在流動相中注入樣品（用流動相溶解樣品進(jìn)樣）
低溫	增加柱的溫度 （升高柱溫）

1. 峰形
1.1.在RP-HPLC應(yīng)用之初，峰拖尾就是最常見的峰形問題（拖尾峰是RP-HPLC自出現(xiàn)以來最普遍的峰形問題）。

大多數(shù)峰拖尾是由于柱內(nèi)硅膠顆粒表面上的酸性或離子化硅烷醇基團(tuán)之間相互作用而導(dǎo)致的。

低純度硅膠（通常稱為“A型”或酸性硅膠）具有高含量的酸性硅烷醇（-Si-OH）基團(tuán)，其富含的金屬雜質(zhì)（特別是鐵和鋁）可提供陽離子交換位點(diǎn)，進(jìn)一步促使這些基團(tuán)電離成-Si-O-。

這些材料的pKa在pH4-5區(qū)域中，這意味著在pH>6時，大部分硅烷醇基團(tuán)會被電離（已離子化）。

通過提高純度并降低硅膠的酸度可獲得更高純度的硅膠顆粒（“B型”），并且自引入（其出現(xiàn)）以來，這些硅膠填料的純度已經(jīng)得到了改善（有所提高）。

高純度硅膠的pKa> 8，因此對于大多數(shù)色譜柱，在2 <pH <8的穩(wěn)定范圍內(nèi)僅有微量的硅烷醇被電離。
堿性化合物極易受到硅醇拖尾（影響而導(dǎo)致拖尾），并且由于大多數(shù)樣品分子含有堿性氮官能團(tuán)，所以沒有多少（很少有）化合物可以完全對硅醇交互作用免疫（不受硅醇基的影響）。

圖1顯示了硅醇拖尾的情況。甲苯是一種中性化合物，不會產(chǎn)生硅醇拖尾現(xiàn)象，但圖1中剩余（其他）的分析物為強(qiáng)堿性藥物。

流動相pH值是6，這是影響分離的另一個因素，它會使純度較低的硅膠色譜柱出現(xiàn)硅烷醇離子化現(xiàn)象（對于該分析更大的挑戰(zhàn)在于流動相pH=6，這一條件下低純度硅膠色譜柱的硅醇基已離子化）。

低純度硅膠（“A型”硅膠）（圖1a）會與堿發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，致使分析物不會從柱上洗脫下來（以至不能從色譜柱中洗脫這些分析物）。

早期的B型材料（圖1b）顯著改善了峰形，盡管它們均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，但樣品中的所有峰形均可見（可以看到樣品中所有分析物出峰）。

通過進(jìn)一步改善（提高）硅膠純度（圖1c），可使峰拖尾降低至可接受的水平。

只要在RP-HPLC中使用含硅烷醇的硅膠，就不可能消除峰拖尾現(xiàn)象。

雖然使用高純度硅膠色譜柱是改善硅烷醇拖尾的最佳辦法，但仍存在其它解決拖尾現(xiàn)象的技術(shù)（技術(shù)可以減少拖尾）。

近年來，多采用將三乙胺（TEA）（一種小（低）分子量堿）加入到流動相（例如25mM）中的方法改善峰拖尾。

TEA是酸性硅烷醇基團(tuán)的有力競爭者，但對于當(dāng)今的高純度硅膠，幾乎無需或很少使用TEA。

圖1：

圖1. 硅膠純度和峰拖尾(a) 低-、(b) 中-、和(c) 高-純度硅膠。
色譜柱：250x4.6mm, 5m；

流動相：80:20 MeOH/25mM KH2PO4(pH 6.0)；
流量：1.0 mL/min；

成分：1, 去甲麻黃堿；2, 去甲替林；3, 甲苯；4, 丙咪嗪；5, 阿米替林。

1.2.緩沖液或流動相添加劑不足也會導(dǎo)致峰拖尾。

緩沖液主要用來使樣品處于（保持）恒定的離子化狀態(tài)，從而穩(wěn)定保留情況（時間），并在最大程度上減少因離子相互作用而導(dǎo)致的峰拖尾現(xiàn)象。

緩沖液還可抑制硅膠表面上的硅烷醇基團(tuán)的電離現(xiàn)象（的硅醇基離子化）。

但是對于低純度硅膠材料來說，由于其硅烷醇更容易被電離，所以它的挑戰(zhàn)性更高（當(dāng)然，這對于低純度的硅膠材料是更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榭赡芨喙璐蓟鶗x子化的）。

添加劑濃度對峰形的影響如圖2所示。

在這種情況下，三氟乙酸（TFA）會作為蛋白質(zhì)樣品成分的離子對試劑，也會產(chǎn)生（可提供）低pH流動相以抑制硅烷醇電離。

通常，0.1％TFA可以（作為添加劑）用于蛋白質(zhì)和肽分離。

如圖2a和b所示，該濃度足以在最大程度上改善高純度和中純度硅膠柱的拖尾現(xiàn)象。

然而，如果TFA濃度下降（降低）十倍（圖2c，d），兩個相（兩個固定相）的拖尾均會隨之增加。高純度硅膠仍可（仍然）保持可接受的峰形，但中純度色譜柱的峰拖尾則無法接受。

緩沖液和其它流動相添加劑的一個共同特征是：作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時間的穩(wěn)定）會從低濃度開始（開始顯現(xiàn)），并隨著濃度的增加而繼續(xù)作用（增加），但會逐漸（趨平）維持在一個穩(wěn)定水平。

穩(wěn)定水平之下的添加劑濃度，可以保持穩(wěn)定的運(yùn)行；濃度過高會產(chǎn)生（可能導(dǎo)致）溶解性問題。

對于大多數(shù)應(yīng)用來說，10-25mM內(nèi)的添加劑已經(jīng)足夠了，但最好根據(jù)具體情況確定。

圖2. 緩沖液濃度對峰拖尾的影響。

0.1％TFA與（a）高純度（b）中純度硅膠柱；0.01％TFA與（c）高純度和（d）中純度硅膠柱。

色譜柱：250x4.6mm, 5m, C18 300?；

流動相：A: 0.1%或0.01%的TFA溶于水中；B: 0.1%或0.01%的TFA溶于ACN；5-70% B，30分鐘；

流量：1.0 mL/min, 280nm。

成分（保留順序）：核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫輔基肌紅蛋白。

1.3.色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學(xué)作用。

如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖3），則問題最早應(yīng)出現(xiàn)在分析物通過色譜柱遷移之前（主要問題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前）。

這種峰形變形最常見的致因是：玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞（此類峰變形最常見的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷）。

除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會受到空隙的影響（輕易不會發(fā)生塌陷）。

但是，玻璃料（篩板）堵塞仍然是一個普遍存在的問題。對于5m顆粒柱（的色譜柱），入口端的玻璃料（篩板）通常具有2.0m的孔隙度；對于（顆粒）3m的色譜柱，具有0.5m的孔隙度。
如果顆粒物來自于樣品，或顆粒物是因泵密封磨損或流動相到達(dá)色譜柱而產(chǎn)生的（磨損的泵密封圈或者流動相顆粒物進(jìn)入色譜），它們通常會集中在玻璃料上（都聚集在篩板上）。

這些顆粒會影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動路徑到達(dá)色譜柱，因此會晚于另一部分樣品。
由于此時（此位置）未發(fā)生分離，因此所有分析物會以相同的方式變形（被擾亂），進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。

為了防止（避免）這一問題，如果流動相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對其進(jìn)行過濾；并在泵密封嚴(yán)重磨損（導(dǎo)致顆粒物的產(chǎn)生）之前更換新的泵密封（密封圈）。

如果樣品含有顆粒碎片（屑），應(yīng)對樣品進(jìn)行過濾（例如0.5m孔隙度過濾器（微孔濾膜））或?qū)ζ溥M(jìn)行短暫離心（例如5分鐘，>1500×g），以去除顆粒。

我們強(qiáng)烈建議在自動進(jìn)樣器下游（之后）安裝0.5m孔隙度的串聯(lián)（在線）過濾器，以過濾任何意外進(jìn)入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)（在線）過濾器玻璃料（濾片）發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會升高；而更換玻璃料（濾片）十分簡單、快速和經(jīng)濟(jì)。采用串聯(lián)（在線）過濾器可顯著延長色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

圖3. 由于玻璃料或色譜柱空隙被部分堵塞（色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷），色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形。

1.4.如果峰形解析不正確（未完全分離的重疊峰），可能會被誤認(rèn)為柱（色譜柱）或緩沖液的問題。

如果僅部分解析兩個峰形（兩個峰僅有部分分開），則可能會認(rèn)為其是裂峰或雙峰。如圖4顯示的情形。

在圖4a中，可觀察到與圖3極為類似的峰值變形（峰變形），其表明玻璃料被堵塞（篩板堵塞）。

改變柱并未糾正這個問題（更換色譜柱不能解決此問題），所以玻璃料（篩板）堵塞并非導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。如果柱上樣品的質(zhì)量減少（減少上樣量）（圖4b），峰形看起來更像是兩個峰，而不是一個肩形峰。

這便需要進(jìn)一步研究，以確定是否存在第二個峰。可以通過修改方法條件來完全分離兩個峰（由此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，證實(shí)了存在第二個峰。

調(diào)整方法的條件后，兩個峰完全分離）。

圖4. 由于存在第二個組分而產(chǎn)生分裂峰。

（a）25ng / mL，和（b）等離子體中10ng/ mL的藥物（第二個峰）（10 ng/mL血漿中的藥物（第二個峰））。來源[1]。

1.5.由于目前的色譜柱性能優(yōu)良，因此極不可能出現(xiàn)伸舌峰（伸舌峰的現(xiàn)象隨著現(xiàn)今柱填充技術(shù)的提高已相當(dāng)少見）。

伸舌峰一般是由柱過載或柱結(jié)構(gòu)塌陷導(dǎo)致的（發(fā)生伸舌峰的一個原因是色譜柱內(nèi)發(fā)生溝流或色譜柱結(jié)構(gòu)的坍塌）。

如果在制造商推薦的條件下使用色譜柱，這種情況則很少發(fā)生。

大多數(shù)硅膠柱在pH2-8的范圍內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

pH低于2時，鍵合相會發(fā)生水解；pH高于8時，硅膠會溶解。

如果（如果您需要）在此pH范圍以外使用（操作）HPLC系統(tǒng)，請確保選擇在選定條件下會保持穩(wěn)定的色譜柱。

圖5顯示了因柱過載（色譜柱發(fā)生溝流）導(dǎo)致的伸舌峰。

圖5a中顯示了正常的峰值形（峰形）;在大約500次注射（進(jìn)樣）后，觀察到伸舌峰（圖5b）。

使用這種方法便會出現(xiàn)這種變化，并且在每次運(yùn)行的過程中會經(jīng)常出現(xiàn)（這種改變是該方法所特有，經(jīng)常在前一次分析結(jié)束后，下一次分析開始時突然發(fā)生）。

出現(xiàn)伸舌峰后，唯一有效的解決辦法就是更換色譜柱。

該柱為100x2.1mm（直徑（內(nèi)徑）），色譜柱填充5mC18顆粒（柱內(nèi)填充5μm 粒徑的C18填料） 。流動相A是10mM碳酸氫銨（pH9.0） ； B是甲醇（MeOH）。

該方法包括5％B等度洗脫段，接下來是80％B的沖洗（然后用80%B淋洗）。

這種特殊的色譜柱可專門用于高達(dá)100％的水流動相，且無封端。

當(dāng)流動相pH值升高時，封端可保護(hù)硅膠免于溶解。

在這種情況下，所使用的色譜柱流動相pH應(yīng)遠(yuǎn)高于推薦的范圍，并且無需保護(hù)性封端。硅膠在pH為9時會逐漸溶解，直到柱床結(jié)構(gòu)不再穩(wěn)定，并且柱床會發(fā)生移動，
產(chǎn)生空隙（塌陷）或通道，而這又會導(dǎo)致圖5b伸舌峰的形成。

可以使用較低的流動相pH或采用在較高pH下能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)的色譜柱，以避免這一問題（避免這一問題）。

圖5. 過載導(dǎo)致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。來源[2]。