如何選擇符合需求的HPLC或UHPLC色譜柱

1.利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過去幾年里，柱效和使用超高效色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實現分離目標的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過更快速的分離和更快速的方法開發提高實驗室生產力來證明了其價值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強調柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個參數中，選擇性是最為重要的。

（參見圖1）通過利用柱效和選擇性，通常可以實現更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發分離方法時的最佳優化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機制，這可以用來實現分離。

這些相互作用機制包括：疏水性結合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機制，這取決于分析物和流動相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機制/相互作用

ACE 鍵合相	疏水性結合	π–π	氫鍵結合	偶極-偶極	形狀選擇性
C18	強	無	無	無	弱
C18-HL	極強	無	無	無	弱
C18-AR	強	強	中等	中等	中等
C18-PFP	強	強	強	強	強
AQ	中等	無	中等	弱	無
C8	中等	無	無	無	無
C4	弱	無	無	無	無
苯基	中等	強	弱	中等	弱
CN	弱	無	弱	強	無

利用鍵合相的選擇性實現更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機制（特別是疏水性結合）的強度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機制，可以為復雜的混合物帶來更好的分離效果。對于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優勢。

當開發分離方法時，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機制。

非常強大且獨特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過利用柱效和選擇性，可以實現更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內從3至100%B，并持續1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡因
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實例。

一個分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得卓越的分離度和峰形：藥物及其相關物質的UHPLC結果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內從3至100%B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測：UV 254 nm

樣品
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優越的總體分離性能。

2.ACE和ACE Excel硅膠基質固定相幾乎消除了硅醇基對色譜分離的不利影響，并且在為堿性化合物提供卓越峰形方面贏得了口碑。

峰拖尾可以降低分離度，降低靈敏度，甚至干擾準確度和精密度（圖4）。

峰拖尾有許多潛在的原因，但分離堿性物質時的主要原因是硅膠固定相載體顆粒表面上的酸性硅醇基與分析物上的氨基之間的相互作用（圖5）。

圖 4：峰拖尾對分離度和靈敏度的影響

隨著峰拖尾（Tf，拖尾因子）從1.0增加到2.0，分離度（Rs）從1.5下降到0.87。

由于峰寬增加以及峰面積保持不變，靈敏度（峰高）也隨著峰拖尾的增加而下降。

ACE色譜柱采用具有極低硅醇活性的超惰性硅膠制成。

這種超純硅膠采用專利技術進行有效鍵合和徹底封尾。

導致這種硅膠基質的固定相幾乎消除了硅醇基對色譜分離的不利影響。

ACE色譜柱的超惰性特性使其成為分離極性堿性化合物的理想選擇。

當分離復雜堿性化合物時,與其他現代堿性去活色譜柱相比，ACE色譜柱總是能給出明顯更好的峰形和柱效（圖6）。

圖 5：峰拖尾相互作用

硅膠固定相載體表面上的酸性硅醇基可形成與堿性化合物相互作用的離子交換位點。

這種離子交換的相互作用通常可以導致峰保留（二次保留），并當采用反相HPLC分離胺類化合物時引起峰拖尾。

一種幾乎消除了硅醇基對色譜分離不利影響的硅膠基質固定相

圖 6：峰拖尾比較

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm
流動相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
溫度：22oC
樣品：吡啶

報告了堿性化合物（吡啶）在各種常見C18色譜柱上的塔板數。

在10％峰高下測量塔板數，以使峰拖尾納入在測量中。

ACE C18-PFP由于其超惰性性質而達到了最高塔板數。

3.ACE Excel為UHPLC帶來了享有盛譽的ACE HPLC性能

重要的是要認識到色譜柱的選擇性和柱效是獨立的變量，在開發分離方法時您不必選擇使用一種而不使用另一種。事實上，為了實現最佳的總體分離效果，您應當對上述兩個變量以及保留值進
行優化。當需要實現高速分離時尤其如此。（參見圖7）

圖 7：利用柱效和鍵合相選擇性來開發更快的分離方法

條件：
流動相：

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱溫：40℃
檢測：PDA, 254nm

樣品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色譜柱更高的柱效，可在更高的流動相流速下使用更短的色譜柱，以使這種混合物的分離時間縮短80%（相比HPLC色譜柱）。
然而，也可以通過優化鍵合相的選擇性來進一步縮短分離時間，在這個案例中，就是利用了C18-PFP鍵合相所具有的增強的選擇性。

與C18UHPLC色譜柱、C18 HPLC色譜柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色譜柱分別將混合物的分離時間縮短了80％以上以及96％，同時保持了所有峰的極佳分離度。

ACE Excel UHPLC色譜柱的設計旨在充分利用低擴散、超高壓UPLC®和UHPLC儀器（高達1000 bar），并可與所有市售UPLC和UHPLC系統相兼容。
ACE Excel UHPLC色譜柱可以為堿性化合物提供更佳的峰形，改善柱子與柱子之間的重現性，提供額外的利用多種分離機制的固定相，以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色譜柱的可用性意味著色譜分析師在使用UPLC和UHPLC儀器時有更多的選擇來獲得更好的結果。

圖 8：ACE Excel色譜柱提供快速、高分辨率的分離

條件
色譜柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流動相：60秒內從30%B至100%B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱溫：40oC
壓力：703 bar (10,335 psi)
檢測：PDA, 254 nm
儀器：安捷倫1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色譜柱可在不到60秒內提供這9種分析物的基線分離。

4.已經證實ACE HPLC色譜柱和ACE Excel UHPLC色譜柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和卓越的色譜柱壽命。

通過鍵合在硅膠固定相載體上的硅氧烷的酸化水解可以失去鍵合相，從而降低色譜柱的壽命。該酸水解隨著流動相pH的降低和柱溫的升高而增加。

與C18相相比，較短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去鍵合相。此外，低純度的硅膠固定相載體和低表面覆蓋的固定相載體使得一些鍵合相更易于酸解。
由于使用超高純度的硅膠固定載體粒子以及鍵合相的極高表面覆蓋，ACE鍵合相表現出極高的穩定性。（參見圖9）
盡管所有ACE鍵合相的穩定性都很優異，但是一些鍵合相并不像其它鍵合相那樣穩定。例如，通常認為C18鍵合比柱長較短的烷基相、PFP相和苯基鍵合相更穩定。

實際上，典型的苯基固定相穩定性不佳是該相在方法開發中不常被選擇的主要原因之一。
為了解決這個問題而開發了ACE C18-AR，其允許色譜分析利用強大的π-π和偶極-偶極分離機制，并仍然享有C18相的堅固性及耐用性。

如圖10所示，ACE C18-AR不僅對典型的苯基鍵合相具有非常優異的穩定性，它甚至還比許多其他C18鍵合相表現出更佳的穩定性。

類似地，ACE C18-PFP提供了多種分離機制，可以利用它們實現更佳的總體分離效果，同時從C18相的穩定性中受益。

圖 9：酸穩定性，pH 1.8

條件
色譜柱：ACE 4.6 x 150 mm
流動相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
溫度：22 °C
分析物：菲

酸性暴露條件：
流動相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
溫度：22 ℃

圖10：加速柱穩定性研究：pH 1.9時80℃

酸性暴露條件：
流動相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
溫度：80 ℃
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲

使用設計用于加速柱降解下的條件，ACE C18-AR相顯示保留損失極少，其壽命相當于高度穩定的ACE C18相。兩種固定相均由相同的超純硅膠而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾視作在高溫和低pH條件下具有極好穩定性的固定相）。
正如預期的那樣，基于低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）的C18鍵合柱在這些加速條件下壽命大大降低。
特別值得注意的是常規苯基色譜柱與ACE C18-AR的壽命比較結果。與ACE C18-AR相比，盡管使用高純度二氧化硅，苯基色譜柱的壽命仍降低，這表明ACE C18-AR可能適用于那些使用苯丙基色譜柱壽命短的應用。

將HPLC和UHPLC連接到通常被稱為LC-MS的質譜儀上已經相當普遍。

然而，質譜對可能從HPLC/UHPLC色譜柱上洗脫下來的微量的鍵合相（稱為柱“流失”）非常敏感。柱

流失可能會干擾分析結果，并且重要的是，LC-MS應用中所選擇的色譜柱具有足夠穩定的鍵合相以避免過量的柱流失。

圖11表明ACE C18-PFP色譜柱幾乎沒有“流失”干擾LC-MS分析。

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的穩定性使得這些色譜柱更適合LC-MS應用。

圖 11：ACE C18-PFP色譜柱的低柱流失使其成為LC/MS應用中的理想選擇

條件
色譜柱尺寸：50 x 3.0 mm
流動相：梯度：在5分鐘內從5至95% B，95% B時持續5分鐘
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
溫度：60oC
檢測：安捷倫1100 MSD ESI正離子快速掃描模式,快速掃描全50 – 1000 m/z
樣品：空白運行

柱流失可能會干擾LC-MS應用中目標分析物的檢測和測量。

ACE C18-PFP色譜柱未顯示柱流失。

所有ACE色譜柱的低流失特性使其非常適合LC-MS應用。

UHPLC色譜柱可能缺乏耐用性。加上入口篩板堵塞的可能性，您可能面臨色譜柱的耐用性不如HPLC色譜柱的問題。

ACE Excel色譜柱非常寬容，并提供您期望從HPLC色譜柱中獲得的相同耐用性和使用壽命。

ACE Excel將改變您對UHPLC色譜柱耐用性的看法。

ACE Excel色譜柱不僅填裝的更好，還采用了專利的入口篩板設計，使其比其它UHPLC色譜柱更不容易被堵塞。

仍建議您像使用任何UHPLC色譜柱一樣過濾樣品和流動相，但ACE Excel色譜柱比其他UHPLC色譜柱更為寬容，并提供與HPLC色譜柱相同的耐用性和使用壽命。

圖 12：ACE Excel色譜柱在耐用性方面有良好的口碑

將2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色譜柱在平均1,000 bar（14,500 psi）壓力下進行2000多個梯度的運行。

在該穩定性研究結束時，柱效（塔板數）和保留時間基本保持不變。

5.ACE Excel色譜柱具有口碑卓越的可重現性。

柱子與柱子之間的可重現性受硅膠固定相載體的生成、固定相與固定相載體的鍵合以及色譜柱中固定相的填充的影響。

在色譜柱的制備過程中，每個階段被控制得越好，色譜柱的可重現性和質量則越好。
ACE色譜柱在色譜柱制備過程中的每個階段均得到了全面控制。

這些控制措施確保ACE色譜柱在柱間以及批次之間產生可靠且可預測的性能。

圖13提供了典型批次驗證測試的實例。

硅醇活性的細微變化是柱子與柱子之間選擇性變化的主要原因之一。

ACE和ACE Excel色譜柱由于使用超純試劑和嚴格的制造工藝控制（可以獲得具有均一表面特性的高純度硅膠固定相載體）而具有出色的可重現性。

將這種高純度硅膠與先進的鍵合技術相結合，可以產生一系列高惰性的固定相，這些固定相幾乎消除了色譜中的硅醇干擾，從而提供卓越的柱子與柱子之間的可重現性。

6.ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴展性。

相同的質量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進行轉換，或需要分離和純化目標化合物時放大到制備應用上。

柱效當然會改變，但可以預料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進行操作時，可以預見到分析物一致的譜帶間距類型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對羥基苯甲酸乙酯

試驗樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明分離從UHPLC擴展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當使用ACE Excel UHPLC色譜柱進行快速方法開發，且該方法必須可轉移到HPLC時，易擴展性則顯得特別有價值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動相：1.4分鐘內從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時持續0.30分鐘，在1.10分鐘內從30至90％B，在90％B時持續0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運行
儀器：島津Prominence UFLC系統

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明ACE固定相的選擇性一致，無論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉移更加容易。同時也使得從分析型應用擴展到制備型應用更加容易。