層析柱是層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。
根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同，從而分離的一種層析法。
選柱子：有玻璃柱和不銹鋼柱兩種，實驗室常用玻璃柱。徑高比一般在1:5-10。
根據(jù)吸附劑用量（體積)確定柱子大小，一般吸附劑應(yīng)填充到柱子體積的1/4-1/5。
灌柱子方法
柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。
其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。 減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié))，以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長)。 加壓柱是種比較好的方法，與常壓柱類似，只是外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或小氣泵。
特別在容易分解的樣品的分離中適用。
壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
柱子的尺寸為粗長的最好。柱子越長，相應(yīng)的塔板數(shù)就越高。柱子越，上樣后樣品的原點就越小（反映在柱子上就是樣品層比較薄)，這樣相對的減小了分離的難度。 無水無氧柱適用于對氧、水敏感，易分解的產(chǎn)品。可以濕柱，也可以干柱。
不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和硅膠飽和時放出的熱量有可能使產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的物質(zhì)，小心不為過。因為分離的物質(zhì)比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。
至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。
如果樣品無色，只好準備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之后就知道樣品在哪，也就可以省些了。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。
因為硅膠中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。
而氧化鋁有堿性、中性和酸性的，選擇余地比較大，但比硅膠要貴些。
聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗證過。
選擇吸附劑：200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠。
干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。
推薦硅膠量是樣品量的30-40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開(是指在所需組分Rf在0.2-0.4，雜質(zhì)相差0.1以上)，就可以少用硅膠。 用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。
所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點先出，而前面的點后出。
這時可以采用氧化鋁作固定相。
常用吸附劑的種類：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣（鎂)、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。 （1)氧化鋁：市售層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三類，粒度規(guī)格大多為100-150目。
堿性氧化鋁（pH9—10)：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿)和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等)，也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。
但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙酰化、維生素A和K等的破壞等不良副反應(yīng)。所以，這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁（pH3.5—4.5)：適用于酸性物質(zhì)如有機酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。
中性氧化鋁（pH7—7.5)：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和堿等。
（2)硅膠：硅膠是硅酸的部分脫水后的產(chǎn)物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。
適用范圍：非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，及一系列合成產(chǎn)品如有機金屬化合物等。
（3)聚酰胺：色譜用聚酰胺主要有錦綸6（聚己內(nèi)酰胺)和錦綸66（聚己二酰己二胺)兩種，分子量一般在16000-20000，其親水性和親脂性均較好，因此既可分離水溶性成份，也可分離脂溶性成分。
可溶于濃鹽酸、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；對堿穩(wěn)定，對強酸可水解。
分
離對象：能與聚酰胺形成氫鍵的化合物，如酚類、酸類、醌類、硝基化合物及含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
形成氫鍵的基團(如酚經(jīng)基、按基、酪基、硝基等)越多，吸附力越強。
如丁二酸＞丁酸 形成氫鍵的位置與吸附力有很大關(guān)系。對位、間位酚羥基使吸附力增大，鄰位使吸附力減小。
芳香核、共軛雙鍵多者吸附力大，少者吸附力小。若形成分子內(nèi)氫鍵，則使化合物的吸附力減小。
（4)硅酸鎂：中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間，主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。
為了得到中性硅酸鎂，用前先用稀鹽酸，然后用醋酸洗滌，最后用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。
柱層析的裝柱非常重要，裝柱的效果會直接影響層析分離效果。
有濕法裝柱和干法裝柱等兩種方法。濕法裝柱很簡單，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脫劑將固定相活成勻漿，柱子底部先用脫脂棉塞緊， 然后倒入洗脫劑將脫脂棉中氣泡趕出。
用漏斗將活好的固定相倒入柱子中， 打開底部活塞， 將柱子中高出固定相的溶劑放出。
期間不斷用橡皮棒敲打， 將固定相敲實， 做到密實均勻無氣泡即可。
很多時候用加壓的方法可以很高效地裝好柱子，而且在柱子中沒有氣泡產(chǎn)生。
干法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是，它是將干燥的吸附劑從柱子上端直接加入到一個空的柱子中， 然后用油泵抽柱子底部， 相當于減壓過柱， 直到柱子變得很結(jié)實， 再用淋洗劑“走柱子” 。干法裝柱的一個缺點就是在裝入洗脫劑后， 由于溶劑和固定相之間的吸附放熱， 所以柱子容易變花，影響分離效果。（2）一定要用較多的溶劑“走柱子”，直到柱子的下端不再發(fā)燙， 恢復到室溫后再撤去壓力。無論使用哪種方法裝柱，最后都要求所裝的柱子結(jié)實、勻稱、無氣泡。上樣也有濕法和干法之分：濕法一般用淋洗劑溶解樣品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶劑越少越好。
再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁緩慢地均勻加入。
在不用海沙的情況下， 盡量不要破壞硅膠面。加樣后， 打開柱底活塞， 讓固定相充分地吸附所加樣品。然后再加入一些洗脫劑，再充分地吸附后將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑， 而不會沖壞硅膠表面。很多樣品在上柱前是粘乎乎的， 一般沒關(guān)系。
有的時候上樣后在硅膠上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)， 是因為硅膠對樣品的吸附飽和， 而樣品本身又是比較好的固體才會析出， 這就需要先重結(jié)晶樣品， 得到大部分的產(chǎn)品后剩余的產(chǎn)品再柱分。
如果不能重結(jié)晶也沒關(guān)系，直接過柱就行， 樣品會隨著淋洗劑流動而慢慢溶解， 最后隨著洗脫劑流出。
有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如 DMF，DMSO等， 會隨著溶劑一起走， 顯色是一個很長的脫尾） ， 這時就必須用干法上柱了。
干法過柱是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠， 拌勻后再旋去溶劑。
一般樣品和硅膠按 1：1 的量混合， 硅膠使用的量也可以少一些， 但是要保證在旋干后， 不能看到明顯的固體顆粒，讓樣品都吸附在硅膠的表面上。然后小心地加入到裝好的柱子中， 加入洗脫劑洗脫。
柱層析按過柱時的壓力可以分為：加壓， 常壓， 減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度， 減少產(chǎn)品收集的時間， 但是會減低柱子的塔板數(shù)。
所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的， 但是時間也最長， 例如一些天然化合物的分離，有時一個柱子過幾個月也有可能。
減壓柱能夠減少硅膠的使用量，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)， 有時會在柱子外面有水汽凝結(jié)， 另外有些比較易分解的東西可能得不到， 而且還必須同時使用水泵抽氣， 噪音大， 時間長， 所以減壓過柱用得比較少。
加壓過柱是一種比較好的方法， 與常壓柱類似， 但用外加壓力可以使淋洗劑走的快些。
壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵 （用魚缸供氣的加壓泵就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中很適用。
一般壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。
因為加壓過柱效率高， 分離效果較好， 所以加壓過柱在普通的有機化合物的分離中是非常適用的。
一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產(chǎn)生氣泡， 使柱子變花， 利用加壓過柱法在裝柱時就可以有效地解決這個問題， 而且可以使柱子很快裝實。隨著科技的發(fā)展， 色譜法的技術(shù)也日新月異， 但柱層析實驗技術(shù)還是比較簡單和實用的， 每個科研工作者在使用柱層析時， 可以根據(jù)自己的實際情況來不斷地摸索，不斷地總結(jié)和提高柱層析的實驗技術(shù)。
