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基因毒性雜質的分析色譜柱方法案例

基因毒性雜質能直接作用于人體中的 DNA，造成 DNA 損傷而具有致癌、致畸或致突變的性質。

少量的基因毒性雜質也能對人體造成極大的損害，對基因毒性雜質的研究已引起了藥物研究者的廣泛關注。

1、定量分析

由于基因毒性雜質危險性極大，美國 FDA 和歐洲藥品管理局(EMA)規定了毒理學擔憂閾值(TTC):人在長期用藥時，潛在毒性雜質每日攝入量不能超過 1.5 μg 。

根據上述規定，每天藥物服用劑量是 200mg，則毒性雜質的質量分數不應超過7.5-×10^-6 ，因此對基因毒性雜質定量分析需要痕量分析的方法。

常用的紫外檢測器最低能夠對質量分數5×10^-4的雜質進行檢測，但隨著 2D-HPLC的發明以及高靈敏度紫外檢測器的使用，藥物中痕量雜質經一維液相儀分離、固相萃取技術富集及二維液相儀高靈敏度檢測也能實現準確定量。

但是，這種方法需要多次高濃度進樣并不適合雜質含量測定。

因此，質譜檢測技術是建立基因毒性雜質定量分析方法的重要前提。Kakasaheb等對坎地沙坦中合成起始原料中的基因毒性雜質利用 GC-MS 的方法進行定量測定，方法學驗證結果能夠符合 ICH 規定的要求，該方法適用于上市藥品中基因毒性雜質的含量測定。

在痕量的雜質進行方法建立過程中，樣品的前處理方式十分重要，微量的損失可能對結果造成極大的影響，Devenport 等創新性地在大氣壓條件下利用質譜直接定量出模擬藥物中基因毒性雜質，這種方法使樣品測定更加便捷，并可實現對藥物的高通量檢測。

2、毒性雜質的確定

2006 年，EMA 發布了遺傳毒性限度的指導原則，此后 ICH、FDA 以及我國的藥品審評中心也提出了對基因毒性雜質的研究和控制方案。根據相關的指導原則，即使雜質的含量在規定的定量要求以下也需要對雜質進行毒性評估。

對化合物毒性評估是通過體外細菌毒性實驗實現的，同時指導原則推薦使用雜質單體進行研究。然而，藥物中的毒性雜質都是微量或痕量存在的，通過制備等方法獲取雜質單體耗時長且成本高。

為此，FDA 和其他公司共同開發了計算機軟件用于評估化合物的毒性。此軟件無需獲取單體，對雜質的結構進行鑒定后，即可使用毒性評估軟件評估雜質的結構是否存在警示結構。

在軟件方面，FDA 推薦使用MC4PC、MDL-QSAＲ以及 Derk for Window 等進行評估。為了對毒性得以準確性的評估，每種軟件擁有特殊的算法和適用范圍：

MC4PC軟件是將待評估的結構拆分成 2~3 個(非氫)原子的結構碎片，再將這些碎片與已知毒性化合物碎片數據庫進行比對，對雜質結構中的碎片做出了毒性累加得分并描繪結構的分子特征，最終生成一個全面而且專業的報告評估雜質的結構毒性。

雖然 MC4PC能夠從雜質的精細結構角度評估藥物的毒性，但是其只能在已有的數據庫中搜索相同的碎片進行比較，對多于一種未知碎片的結構卻不能全面評估。

毒性化合物的研究結果表明毒性化合物結構中都存在著親電子基團或可被激活為親電子基團的結構，MDL-QSAＲ毒性評估軟件是基于化合物的毒性和該化合物的親電能力的相關性做出評估，這種軟件可計算出化合物結構與其毒性的定量關系，同時可以預測體外細菌毒性實驗的結果。

然而，為了達到對已知結構的雜質毒性的最準確評估，使用 MDL-QSAＲ軟件時需尋找到最適合的模型用以計算，因此在該計算軟件提出后，有許多關于不同的數據模型以及對它們的評估的報道。

有些雜質雖經計算機評估結果為有警示結構的潛在毒性雜質，但由于評估軟件在計算過程中會過分評估雜質的毒性，所以在判定藥物雜質是否為毒性雜質仍需要進行體外細菌回復突變實驗(Ames 實驗)或哺乳動物細胞分析，FDA對該實驗的過程給予詳細的說明。

3、控制方法

根據 EMA 指導原則以及對指導原則問題解答，藥物中所有存在的化合物均應該通過化合物毒性評估或符合指導原則的控制方法，同時為了確定潛在毒性雜質是否為毒性雜質需要進行Ames實驗。

展望

雜質研究在藥物研發過程中占有及其重要的地位，不僅影響著新藥上市的速度，更影人類用藥安全。隨著分析技術的不斷發展，雜質研究的策略已經變得愈發多樣化。隨著檢測器分辨率以及靈敏度的提高，雜質定量實現了由微量到痕量的飛躍，雜質的定性工作也實現了由離線到在線檢測的轉變。然而，新藥研發速度的加快，生物藥物的不斷涌現以及快速定性定量分析的要求，將給研究人員帶來極大的挑戰。